LAPORAN PRAKTIKUM
GENETIKA
PERCOBAAN II
ISOLASI DNA
NAMA : ASTRID SAFIRA IDHAM
NIM : H41113341
HARI/TANGGAL : KAMIS, 13 MARET 2014
KELOMPOK : VI (ENAM) B
ASISTEN : ANDRI NINDYA
LABORATORIUM GENETIKA JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2014
BAB I
PENDAHULUAN
I.1 Latar Belakang
Deoxyribonucleic acid atau DNA merupakan senyawa kimia yang paling penting dalam makhluk hidup.DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi genetik makhluk hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya. Keseluruhan DNA dalam suatu sel akan membentuk genom. Genom meliputi bagian gen yang fungsional maupun non-fungsional dalam sel organisme. DNA genom meliputi gen danintergen (Suryo, 2004).
DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitikondria, dan kloroplas. Perbedaan ketiganya adalah DNA nukleus berbentuk linier dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Sedangkan DNA nukleus memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linier dan memiliki protein histon (Kirsman, 2010).
Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsipisolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untukmemisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung . Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Rachmat, 2012).
I.2 Tujuan Percobaan
Adapun tujuan yang akan dicapai pada percobaan isolasi DNA ini yaitu untuk mengetahui cara memisahkan (mengisolasi) DNA dari 2 jenis buah yang dijadikan sebagai sampel, serta untuk mengetahui keaktifan detergen dalam proses isolasi DNA pada sampel buah.
I.3 Waktu dan Tempat Percobaan
Percobaan ini dilaksanakan pada hari Kamis, 13 Maret 2014, pukul 14.00 – 17.30 WITA. Percobaan ini bertempat di Laboratorium Biologi Dasar, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Hsanuddin, Makassar.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Isolasi DNA adalah proses pengeluaran DNA dari tempatnya berada (ekstraksi atau lisis) biasanya dilakukan dengan homogenasi dan penambahan buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk mencegah DNA rusak (Yuwono, 2008).
Pada sel eukariotik termasuk tanaman dan hewan bagian terbesar dari DNA berada pada nukleus yaitu organel yang dipisahkan dari sitoplasma dengan membran. Nukleus terdiri dari 90 % keseluruhan DNA seluler. Sisa DNA adalah organel lain seperti mitokondria dan kloroplas. Karena DNA terdapat pada nukleus, maka perlu adanya metode pelisisan sel sampai pemanenan sel. Dimana metode tersebut merupakan bagian dari metode isolasi DNA (Elrod, 2007).
Pemisahan DNA dari materi seluler lainnya merupakan hal yang signifikan dan mengharuskan penyallinan DNA menjadi RNA dan translasi RNA menjadi protein berlangsung dalam kompartemen( ruang ) yang berbeda yaitu secara berturut-turut dalam nucleus dan sitoplasma ( Elrod, 2007 ).
Terdapat organel-organel bermembran ganda di dalam sitoplasma, termasuk mitokondria baik pada tumbuhan maupun hewan. Oleh karena itu perlu dilakukan isolasi DNA pada tanaman dan hewan untuk mengetahui dan mempelajari DNA dari tanaman dan hewan tersebut. Sel eukariotik memiliki DNA lebih banyak, lengkap dengan komponen-komponen lain. DNA tanaman dan hewan tersimpan dalam nucleusyang terbungkus oleh membran. Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi.Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah. Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran (Albert, 1994).
DNA pada makhluk hidup dapat diisolasi secara sederhana. Pengisolasian DNA secara sederhana dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti baik secara mekanik maupun secara kimiawi. Isolasi DNA merupakan suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan. Pemecahan dinding sel secara mekanik dapat dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara kimiawi dapat dilakukan dengan pemberian detergen. Penambahan sabun cair dan garam dapur adalah untuk melisiskan membran inti untuk mengeluarkan isi inti sel yang berisi DNA (Rachmat, 2012).
Isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain: preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sample buah, maka kadar air pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda-beda pula. Semakin tinggi kadar air, maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit (Kirsman, 2010).
Penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat menyebabkan rusaknya membrane sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak pada membrane membentuk senyawa “lipid protein-deterjen kompleks”. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan deterjen, sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia (Kirsman, 2010).
Prinsip – prinsip dalam mengisolasi DNA (Tohib, 2012) :
1. melisis sel secara fisik, dengan cara penggerusan.
2. pemecahan dinding sel.
3. pemecahan membran sel.
4. pemisahan DNA dari bahan yang lain.
Dalam isolasi DNA, bahan yang kita gunakan biasanya berupa jaringan tumbuhan atau jaringan hewan, untuk itu langkah pertama yang harus kita lakukan adalah memecahkan jaringan menjadi sel-sel yang mandiri. Proses dilakukan secara mekanik atau fisik dengan menumbuk atau menggerus bahan yang akan kita gunakan dengan mortar atau blender. Kedua adalah memecahkan dinding sel dan membran sel lapisan pembungkus DNA. struktur utama pembentuk membran dan dinding sel adalah lemak, untuk itu kita gunakan deterjen dan garam dapur. Kedua bahan ini digunakan untuk melubangi dan merusak sel sehingga isi inti sel (DNA) bisa keluar (Tohib, 2012).
Tahap selanjutnya adalah pemisahan DNA dari bahan yang lain. Pemisahan dilakukan dengan menggunakan ethanol/alkohol dingin berkonsentrasi 90-95%. Ethanol/Alkohol tidak melarutkan DNA dan berat jenis alkohol yang lebih ringan dari air membuat DNA naik dan melayang-layang di permukaan (Tohib, 2012).
CTAB atau Cetyl trimethylammonium bromide merupakan sejenis deterjen yang dapat mendegradasi dinding sel, denaturasi protein, memisahkan karbohidrat, merusak membran sel dan melarutkan DNA. Apabila dinding sel terdegradasi maka semua isi sel dapat keluar termasuk DNA dan dilepaskan ke dalam buffer ekstraksi.Dalam proses isolasi DNA tanaman, penambahan senyawa pereduksi seperti merchaptoetanol dapat mencegah proses oksidasi senyawa fenolik sehingga menghambat aktivitas radikal bebas yang dihasilkan oleh oksidasi fenol terhadap asam nukleat. Merchaptoetanol juga berfungsi untuk melindungi RNA dari senyawa quinon, disulphide, peroksida, poliphenoksidase, dan protein. Proses pemansan pertama bertujuan untuk melarutkan CTAB dan mercaptoetanol. Sedangkan pemanasan yang kedua bertujuan untuk memdegradasi protein dan dinding sel (Tohib, 2012).
Klorofrom dan isoamilalkohol (CIAA) berfungsi untuk mengekstrak dan dan mengendapkan komponen polisakarida di dalam buffer ektraksi yang mengkontaminasi larutan DNA. Pemberian isopropanol dan etanol dilakukan agar terjadi dehidrasi DNA sehingga terjadi presipitasi. Setelah pemberian etanol, pellet yang dipeoleh dikeringanginkan. Hal ini bertujuan untuk mengeringkan pellet dari sisa-sisa buffer maupun etanol.Tahapan terakhir dari ektraksi ini adalah penambahan buffer TE. Buffer TE tris electrophoresisberfungsi untuk melarutkan DNA yangdihasilkan dan menjagaDNA agar tidak mudah rusak. Dalam buffer TE mengandung EDTA atau Ethylene Diamine Tetra Acid yang berfungsi sebagai senyawa pengkelat yang mengikat ion Magnesium, yaitu kofaktor yang diperlukan untuk altivtas berbagai enzim nuclease. Metode ekstraksi DNA dengan CTAB akan menghasilkan pita DNA yang berukuran tebal dan dapat memisahkan DNA dari polisakarida karena adanya perbedaan karakteristik kelarutan (differensial of solubility). Disamping deperoleh fragmen DNA, dengan metode CTAB juga akan diperoleh RNA dengan pita tipis yang terletak jauh berada di bawah pita DNA. Keberadaan pita RNA tergantung bahan yang diekstraksi (Asris, 2010).
Metode ini tidak membutuhkan biaya yang lebih mahal dibandingkan dengan menggunakan kit. Selain itu, kelebihan dari ektraksi ini adalah pita DNA yangdiproleh lebih tebal bila dibandinglan dengan ektraksi metode fenol dan tanpa fenol. Akan tetapi, dari hasil dengan metode ini masih terdapat pita smear dan DNA yang dihasilkan lebih sedikit daripada ektraksi dengan menggunakan kit. Kendala yang umum terjadi dalam ekstraksi CTAB adalah adanya inhibitor pada inang, rendahnya konsentrasi vius dan pengaruh cara maupun lama waktu penyimpanan (Asris, 2010).
BAB III
METODE PERCOBAAN
III.1 Alat dan Bahan
III.1.1 Alat
Alat – alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah alat tulis menulis, tabung reaksi, timbangan, gelas aqua, pisau, batang pengaduk, spatula, blender, pipet tetes, dan mesin vortex.
III.1.2 Bahan
Bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah buah tomat Solanum lycopercium dan pepaya Carica papaya, detergen (Rinso cair, Surf bubuk, dan sabun bukrim), Aquades, garam dapur, Ethanol 96 % , dan kertas saring.
III.2 Prosedur Kerja
Adapun langkah-langkah kerja yang dilakukan dalam percobaan ini adalah sebagai berikut:
- Buah dipotong menjadi ukuran yang lebih kecil.
- Buah yang telah dipotong kemudian ditimbang sampai beratnya 100 gr.
- Diambil 100 gr buah dan 100 ml aquades, kemudian diblender hingga halus, kira-kira diblender selama 40 detik.
- Masing-masing buah yang telah diblender dimasukkan kedalam 3 tabung reaksi yang berbeda sebanyak 4 ml.
- Dilarutkan detergen (Rinso, Surf, dan Bukrim) kedalam 60 ml aquades, kemudian diaduk hingga larut.
- Tiga jenis larutan detergen kemudian dimasukkan kedalam masing-masing tabung reaksi yang berisi jus buah sebanyak 4 ml.
- Tambahkan 1 spatula garam dapur kedalam masing-masing tabung reaksi, kemudian diaduk hingga larut.
- Campuran kemudian disaring sebanyak 2 kali dengan kertas saring.
- Lalu ditambahkan ethanol 96 % sebanyak 5 ml kedalam masing-masing campuran.
- Larutan kemudian dihomogenkan dengan menggunakan mesin vortex.
- Amati dan catat hasil yang tampak dari keseluruhan proses, meliputi warna, serta sedikit banyaknya DNA yang terbentuk.
DAFTAR PUSTAKA
Albert, B., 1994. Biologi Molekuler Sel Edisi Kedua. PT. Gramedia Pustaka Utama. JJJJJJJakarta.
Asris., 2010. Definisi Isolasi DNA dan Manfaat Isolasi DNA.http://asris07. Student.ipb.ac.id. Diakses pada tanggal 17 Maret 2014, pada pukul 23.00 WITA.
Elrod, S., 2007. Genetika Edisi Keempat. Erlangga. Jakarta.
Kirsman, 2010.Isolasi DNA Buah. http://kirsman83.weebl..com. Diakses pada tttttttttanggal 17 Maret 2014, pada pukul 23.00 WITA.
Rachmat, 2012. Isolasi DNA. http://rachmatyusuf.blogspot.com. Diakses pada ssssssstanggal 17 Maret 2014, pada pukul 23.00 WITA.
Suryo, 2004. Genetika Strata 1. Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta.
Tohib, 2012. Macam Metode Isolasi DNA. http://www.tohib.web.id. Diakses pada tttttttangga17 Maret 2014, pada pukul 23.00 WITA.
Yuwono, T., 2008. Biologi Molekuler. Erlangga. Jakarta.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
IV.1 Hasil Percobaan
IV.1.1 Gambar Hasil Percobaan
|
JENIS BUAH |
SEBELUM |
SESUDAH |
|
1.PEPAYA Carica papaya |
(bubuk, cair, krim) |
(bubuk, cair, krim) |
|
2.Tomat Solanum lycopercium |
(krim, bubuk, cair) |
(bubuk, cair, krim) |
IV.1.2 Tabel Pengamatan
|
JENIS BUAH |
PERLAKUAN |
HASIL PERCOBAAN |
JUMLAH |
||
|
WARNA |
WAKTU |
||||
|
Pepaya Carica papaya |
Detergen Bubuk |
Putih – bening |
Cepat |
+ + |
|
|
Detergen Cair |
Kuning – bening |
Lambat |
+ + |
||
|
Detergen Krim |
Kuning – pucat |
Sedang |
+ + |
||
|
Tomat Solanum lycopercium |
Detergen Bubuk |
Putih – bening |
Cepat |
+ + |
|
|
Detergen Cair |
Bening |
Lambat |
+ + + |
||
|
Detergen Krim |
Kuning |
Sedang |
+ + + |
||
IV.2 Pembahasan
Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta
pemurnian DNA. Selain itu ada 2 prinsip lagi dalam melakukan isolasi DNA, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi.
Dalam percobaan ini, kami melakukan isolasi DNA yang berasal dari 2 jenis buah yang memiliki kandungan air yang berbeda. Tujuan dari percobaan ini adalah
untuk mengisolasi atau memisahkan DNA yang berasal dari tumbuhan. Metode yang
dilakukan dalam percobaan ini adalah penghancuran (lisis) serta ekstraksi. Perlakuan pertama yang diberikan pada buah yaitu mengupas serta memotongnya menajadi ukuran yang lebih kecil, hal ini dilakukan agar pada saat penghancuran buah mudah dihancurkan menjadi partikel – partikel yang lebih kecil. Tahap selanjutnya yaitu menambahkan campuran detergen dengan air, hal ini bertujuan untuk merusak membran sel dari kedua buah tersebut. Perusakan membran sel terjadi akibat adanya ikatan kimia yang terbentuk antara detergen dengan zat-zat yang ada pada buah. Setelah penambahan detergen tahap selanjutnya yaitu penambahana garam dapur sebanyak 1 spatula ke masing-masing tabung yang berisi campuran buah dan detergen, tujuan dari penambahan garam adalah untuk memudahkan pemisahan benang-benang DNA dari campuran sehingga benang-benang tersebut akan mudah diamati. Hal ini terjadi karena Na+ dalam garam dapat membentuk ikatan pada kutub negative dari ikatan fosfat DNA.Setelah larutan ditambahkan garam larutan kemudian dihomogenkan pada mesin vortex.
Tahap selanjutnya yaitu penambahan ethanol 96 %, penambahan ini bertujuan untuk mempermudah terjadinya presipitasi pada benang-benang DNA.Ethanol tersebut mampu membawa asam nukleat yang terdapat dalam campuran naik ke permukaan, untuk kemudian diendapkan.Setelah ditambahkan ethanol larutan kemudian kembali dihomogenkan pada mesin vortex.
Dari percobaan isolasi DNA diperoleh hasil yaitu, perbedaan warna pada masing-masing tabung reaksi yang berisi campuran buah, detergen, garam, dan ethanol.Perubahan warna yang terjadi diakibatkan oleh perbedaan susunan DNA yang terdapat pada setiap buah. Selain itu perbedaan yang mencolok dari keenam larutan tersebut adalah terdapat banyak atau sedikit endapan asam nukleat pada
dasar tabung reaksi. Hal ini terjadi akibat adanya perbedaan kandungan zat serta penggunaan jenis detergen yang berbeda maupun kandungan air dari masing-masing buah tidak sama. Dari percobaan tidak diperoleh DNA murni melainkan hanya DNA kasar atau benang – benang halus (supernatant) dalam jumlah yang sedikit serta endapan putih yang terlihat. Dari kedua buah DNA kasar yang paling terlihat ada pada buah pepaya, hal itu terjadi akibat kandungan air pepaya lebih sedikit dari tomat sehingga ekstrak dan DNA kasar yang dihasilkan oleh pepaya lebih banyak daripada buah tomat, selain itu endapan putih pada buah pepaya lebih banyak daripada buah tomat.
BAB V
PENUTUP
V.1 Kesimpulan
Dari percobaan isolasi DNA yang telah dilakukan dapat diketahui metode atau cara bagaimana mengisolasi DNA dari buah yang dijadikan sebagai sampel. Yaitu melalu cara penghancuran (lisis), ekstraksi, serta pemurnian. Penggunaan detergen yang berbeda dalam percobaan dilakukan untuk mengetahui detergen dalam bentuk apa yang paling aktif dalam menghancurkan membran sel pada setiap sampel buah.Setelah dilakukan percobaan ternyata detergen bubuk menghasilkan DNA kasar yang lebih terlihat serta endapan putih yang lebih banyak.
V.2 Saran
V.2.1 Saran Untuk Laboratorium
Sebaiknya laboratorium menyediakan alat yang cukup memadai serta alat yang cukup banyak, agar praktikum dalam berjalan dengan efisien.
V.2.2 Saran Untuk Asisten
Diharapkan agar terus memperhatikan dan membimbing praktikan selama lab berlangsung, agar praktikum berjalan dengan baik.
astridsafiraidham 